可溶性纤维介素在移植肾急性排斥中的作用及机制研究

【摘要】目的：急性排斥反应(acuterejection,AR)是肾移植术后的主要并发症,影响移植肾及受者的长期存活。肾小管上皮细胞(tubularepithelialcells,TEC)凋亡是移植肾急排损伤的重要病理表现,但其具体机制尚不明确。可溶性纤维介素(solublefibrinogen-likeprotein2,sFGL2)是调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg)分泌的效应分子,可诱导细胞凋亡从而介导组织损伤。本课题拟研究肾移植术后急排患者的血清sFGL2表达情况,分析其与外周血中促炎因子TNF-α、IFN-γ水平及Treg比例的关联,体外探索TNF-α、IFN-γ对CD4+T细胞分泌sFGL2的刺激作用及相关信号通路,并进一步探究sFGL2对TEC凋亡的影响,拟揭示sFGL2在移植肾急排中的作用,完善Treg在急排中的生物学效应,为进一步阐明移植肾急排的机制及临床防治提供理论依据。方法：收集40名于2010年11月至2011年8月在复旦大学附属中山医院接受移植肾穿刺的同种异体肾移植受者资料,采集外周血,并根据临床表现及移植肾穿刺病理证实结果分为急排组和移植肾功能稳定组(每组20名)。其中急排组根据Banff07病理分级标准进一步分为急性细胞性排斥Ⅰ级组(8名),急性细胞性排斥Ⅱ级组(6名)和急性体液性排斥组(6名)。纳入健康志愿者15名作为正常对照。利用ELISA检测血清sFGL2及TNF-α、IFN-γ水平,采用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。从健康志愿者采集外周血,利用流式磁珠分选技术分离获得CD4+T细胞并体外培养。用不同浓度的TNF-α(62.5、125、250、500、1000U/m1)、IFN-γ(62.5、125、250、500、1000U/m1)或PBS分别刺激CD4+T细胞24、48和72小时,利用ELISA检测培养液上清sFGL2浓度,Phosflow流式细胞术检测CD4+T细胞内MAPK信号通路蛋白磷酸化水平。根据上述结果,用相关MAPK通路蛋白抑制剂干预CD4+T细胞,检测处理后的细胞培养液上清sFGL2水平的变化。此外,用10μg/mlsFGL2、10ng/mlTNF-α(阳性对照)或PBS(阴性对照)体外刺激人TEC48小时,通过AnnexinV-FITC/PI染色,采用流式细胞术检测TEC凋亡情况,并利用RT-qPCR检测TEC凋亡相关基因表达情况。本研究通过复旦大学伦理委员会批准。结果：移植肾急排患者外周血sFGL2水平显著升高,且与排斥严重程度及类型相关：对比40例肾移植受者及15例健康志愿者血清sFGL2水平发现,病理证实急排的患者血清sFGL2水平(64.84±10.36ng/ml,n=20)明显高于移植肾功能稳定的患者(37.82±3.56ng/ml,n=20,p<0.05)或健康志愿者(31.25±4.08ng/ml,n=15,p<0.05),而肾功能稳定的患者与健康志愿者相比无显著差异；病理证实体液性排斥反应的患者血清sFGL2明显高于细胞性排斥反应的患者(118.80±20.28vs.41.71±4.39ng/ml,p<0.001)；在细胞性排斥反应患者中,Banff分级Ⅱ级的患者血清sFGL2明显高于Ⅰ级的患者(51.87±7.81vs.34.10±3.27]ng/ml,p<0.05)。此外,移植肾急排患者外周血促炎因子TNF-(114.90±10.20vs.67.21±8.27pg/ml,p<0.001)、IFN-γ(257.69±28.60vs.88.15±10.85pg/ml,p<0.001)水平与Treg比例(4.05±0.08vs.2.39±0.06%,p<0.001)均较肾功能稳定患者显著升高,且与sFGL2呈正相关(Spearman相关系数r分别为0.962、0.863和0.739,所有p<0.001)。在体外研究中,通过不同浓度的TNF-α、IFN-γ和PBS分别刺激CD4+T细胞,发现在1000U/mlTNF-α(0.947±0.102ng/ml)或62.5U/mlIFN-γ(0.947±0.091ng/ml)刺激48小时的条件下,CD4+T细胞分泌的sFGL2最多。此外,1000U/mlTNF-α(429.33±54.49,p<0.05)或62.5U/mlIFN-γ(520.33±36.57,p<0.01)较PBS(131.67±45.58)刺激时,CD4+T细胞中磷酸化JNK均显著增高；而p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平均无显著性差异。进一步研究显示,经过JNK抑制剂处理的CD4+T细胞JNK磷酸化水平明显减少(TNF-α、IFN-γ、PBS刺激分别为：280.67±0.67vs.399.67±0.33,p<0.001；350.33±0.88vs.517.33±0.33,p<0.001；95.33±1.33vs.138.33±0.67,p<0.001),而培养液上清中sFGL2水平显著降低(TNF-α、IFN-γ、PBS刺激分别为：0.550±0.081vs.0.977±0.108ng/ml,p<0.05；0.548±0.105vs.1.010±0.127ng/ml,p<0.05；0.278±0.050vs.0.514±0.054ng/ml,p<0.05)。此外,采用sFGL2体外刺激,可较PBS更显著诱导TEC凋亡(33.13±0.10vs.12.91±0.35%,p<0.001),不仅诱导早期凋亡(10.19±0.13vs.4.05±0.07%,p<0.001),亦诱导晚期凋亡(22.82±0.41vs.9.44±0.06%,p<0.001)。sFGL2诱导TEC的早期凋亡比例明显高于TNF-α(9.74±0.07%,p<0.05),而晚期凋亡比例和总凋亡比例则明显低于TNF-α(30.63±0.52%,40.34±0.24%,二者均p<0.001)。与PBS相比,sFGL2刺激后TEC中Caspase、TNF、Bcl-2、NFKB等凋亡相关家族中促凋亡基因如CASP-3(p<0.05)、CASP-8(p<0.05)、CASP-9(p<0.05)、CASP-10(p<0.05)、TRADD(p<0.001)、TNFSF10(p<0.01)、FADD(p<0.001)、EAS(p<0.001)、FASLG(p<0.05)、BAK1(p<0.05)、BAD(p<0.05)、BAX(p<0.001)和NF-KB1(p<0.01)均显著上调,而抑凋亡基因如CARD-18、NAIP、BCL2、IKBKB和TBKl的表达则无明显变化。结论：移植肾急排患者外周血sFGL2水平显著升高,与排斥严重程度及病理类型相关,并与外周血促炎因子TNF-α、IFN-γ水平及Treg比例升高呈正关联。在体外,TNF-α和IFN-γ通过增强MAPK信号通路中JNK磷酸化水平刺激CD4+T细胞分泌sFGL2。此外,sFGL2可诱导TEC凋亡,是通过全面上调凋亡信号通路中Caspase、TNF、Bcl-2、NFKB等凋亡相关家族中的促凋亡基因实现的,但对抑凋亡基因的表达则无明显影响。
【作者】赵梓彤；
【导师】朱同玉；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】可溶性纤维介素；移植肾急性排斥；MAPK信号通路；肾小管上皮细胞；凋亡；

【参考文献】
[1]张波.Silicalite-1与Fe-silicalite-1分子筛膜的合成及其在渗透蒸发中的应用[D].天津大学,化学工程,2013,硕士.
[2]李政宪.目的语环境下韩国幼儿汉语教学现状[D].沈阳师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[3]袁莉莉.凡纳滨对虾肉糜凝胶特性研究及虾肉肠的研发[D].广东海洋大学,水产品加工与利用（专业学位）,2013,硕士.
[4]张丽敏.国际海上货物运输合同下的诉权问题研究[D].大连海事大学,国际法学,2004,硕士.
[5]葛永浩.城乡统筹背景下的农民社区治理探索[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[6]何银平.高职应用电子技术专业课程建设思考[J].电子制作,2015,04:167.
[7]何凤亿.Mg-8Al-1.5Ca-0.2Sr镁合金热变形组织演变行为研究[D].湖南大学,材料加工工程,2012,硕士.
[8]宋可莹.聚酰亚胺纳滤膜制备与性能研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[9]常利忠.内蒙古西拉木伦构造混杂岩带物质组成及其构造变形特征[D].中国地质大学（北京）,构造地质学,2014,硕士.
[10]曹瑜,胡光道,杨志峰,沈珍瑶.GIS环境下地质变量自动提取与地质异常的圈定[J].计算机工程与应用,2003,14:81-85.
[11]朱娜.基于电子鼻检测“霞晖5号”桃果实瘀伤和冷害的研究[D].南京农业大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[12]陆璐,李天石,史维祥.一类二维变学习因子自学习控制器[J].控制与决策,1999,04:16-20+26.
[13]庄乾霞.压电自感知执行器的研究与开发[D].大连理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[14]李婷婷.论雅克·马利坦的文艺观[D].山东师范大学,文艺学,2013,硕士.
[15]李超.美国《科学》杂志公布2009十大科学突破[J].化学分析计量,2010,01:32.
[16]焦正.室内空间形态设计风水应用研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[17]王兵,王长友,李越冬.社会转型与国家审计的治理功用:基于嵌入理论的视角[J].审计与经济研究,2014,04:14-21.
[18]王福星.基于ABAQUS对高速铁路环境振动的数值模拟及振动特性分析[D].北京交通大学,2014.
[19]王慧娟.中重核素的加速器质谱测量实验谱的预先研究[D].广西大学,理论物理,2004,硕士.
[20]唐建华.基于神经网络的TD-LTE网络故障诊断技术研究[D].宁波大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[21]郭民怿.配电变压器负序电流动态抑制方法及实验研究[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[22]魏兰.以木质素为原料合成环氧树脂的研究[D].天津科技大学,制浆造纸工程,2004,硕士.
[23]高艳红.基于SOA的铁路客运站旅客服务信息系统研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[24]田永胜.手持移动设备自然用户界面交互范式研究[D].西北大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[25]李根福.化学图表在知识生成和整合中的功能[J].中学化学教学参考,2005,Z2:41-43.
[26]李鹤.连翘酯苷对鸡肝脏抗氧化及抗炎活性研究[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[27]白玉辉.武汉市民之家公共服务研究[D].华中师范大学,公共管理,2014,硕士.
[28]闫潇.绿色建筑及绿色施工评价体系的研究与实践[D].河北工程大学,结构工程,2012,硕士.
[29]成炜.茶多酚诱导肺癌细胞凋亡及P53、bcl-2基因表达的研究[D].青岛大学,内科学,2004,硕士.
[30]孙莉.竹叶椒粗提物药理活性及氯仿部位化学成分初步研究[D].兰州理工大学,食品科学,2014,硕士.
[31]姚虎.经济性特区治理中的核心行动者：生长、异化与规引[D].苏州大学,行政管理,2013,硕士.
[32]胡丽婷.现代陶瓷艺术介入文化空间的应用研究[D].景德镇陶瓷学院,设计艺术学,2014,硕士.
[33]郝贠洪,冯玉江,段国龙,任莹.风沙环境下钢结构涂层的冲蚀摩擦学性能[J].北京工业大学学报,2015,04:558-565.
[34]曹越.基于LED用掺铕钼酸盐红色荧光粉研究[D].西安电子科技大学,材料物理与化学,2012,硕士.
[35]安辉.内混式双流体渣油雾化喷嘴的实验研究[D].大连理工大学,机械制造及其自动化,2003,硕士.
[36]王琪.王夫之理欲观研究[D].湖南工业大学,伦理学,2012,硕士.
[37]张应贤.基于量子纠缠交换的分布式网络时钟同步技术研究[D].西北大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[38]梁先明.国际电工委员会的名词术语工作[J].自然科学术语研究.1985(01)
[39]金沈杰,吴绍春,吴耿锋,严胜祥.基于预聚类技术的并行序贯模式挖掘算法[J].计算机工程与科学,2004,10:66-68+90.
[40]王世鹏.图的b色数和外控制数[D].新疆大学,应用数学,2013,硕士.
[41]王婷.京津冀都市圈金融服务业空间格局及演化[D].首都师范大学,人文地理,2013,硕士.
[42]陆春吉.物联网工程专业课课程体系[J].计算机光盘软件与应用,2014,19:55-56.
[43]刘龙水.通城县花岗岩崩岗剖面优先流孔隙空间分布和水分特征研究[D].华中农业大学,水土保持与荒漠化防治,2014,硕士.
[44]郑晓文.肺癌干细胞的富集、鉴定及调节Hedgehog信号通路对肺癌干细胞功能的影响[D].广西医科大学,呼吸内科学,2014,博士.
[45]金莉.NJ学院教师激励制度研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[46]苏向英.二维过渡金属硫属化合物电子结构的第一性原理研究[D].西北大学,凝聚态物理,2014,博士.
[47]张冲.从修辞角度分析英文广告语的劝说策略[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[48]魏明君.赤峰市绿色物流系统评价研究[D].吉林大学,交通运输工程,2012,硕士.
[49]李进良,麦穗华.加强无中心多信道选址通信网的电波管理[J].移动通信.1989(04)
[50]郭永宽.体外循环心脏跳动中手术对血清胱抑素C和尿白介素-18的影响研究[D].广西医科大学,心胸外科,2013,硕士.